Welche Schritte umfasst das Western Blotting?

Western Blotting ist eine Technik zur Proteinerkennung, die erstmals vom Amerikaner George Stark erfunden wurde. Dabei wird die Elektrophorese-Technologie eingesetzt, um Proteine ​​aus bestimmten Geweben oder Zellen zu trennen, sie auf NC- oder PVDF-Membranen zu fixieren und dann mithilfe spezifischer Antikörper bestimmte Antigene zu erkennen. Da sich mit dieser Technologie krankheitserregende Antigene aufspüren lassen, wird sie heute in vielen biologischen Bereichen, beispielsweise bei der Krankheitsdiagnose, breit eingesetzt. Schauen wir uns die Schritte zur Herstellung von Schweinefüßen an.

1. Grundsatz

Es ähnelt den Hybridisierungsmethoden Southern Blot oder Northern Blot, allerdings wird beim Western Blot eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendet, das zu erkennende Objekt ist ein Protein, die „Sonde“ ist ein Antikörper und die „Entwicklung“ ist ein markierter sekundärer Antikörper. Die durch PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese) getrennte Proteinprobe wird auf einen Festphasenträger (z. B. eine Nitrocellulosemembran) übertragen. Der Festphasenträger adsorbiert das Protein in Form nichtkovalenter Bindungen und kann den durch Elektrophorese getrennten Polypeptidtyp und seine biologische Aktivität unverändert beibehalten. Das Protein oder Polypeptid auf dem Festphasenträger wird als Antigen verwendet, das mit dem entsprechenden Antikörper reagiert und dann mit dem zweiten, mit einem Enzym oder Isotop markierten Antikörper reagiert und durch Substratfarbentwicklung oder Radioautographie nachgewiesen wird.

2. Klassifizierung

Es gibt mehrere Hauptmethoden für die Western Blot-Entwicklung:

i. Autoradiographie

ii. Substrat-Chemilumineszenz ECL

iii. Substratfluoreszenz ECF

iv. DAB-Substrat-Farbentwicklung

Die am häufigsten verwendeten Methoden sind Substrat-Chemilumineszenz-ECL und Substrat-DAB-Kolorimetrie. Die erste Methode wird für das gleiche Niveau und die gleichen Versuchsbedingungen verwendet, und in veröffentlichten Artikeln wird normalerweise Substrat-Chemilumineszenz-ECL verwendet. Sie müssen lediglich ein fertiges Testkit kaufen, und die Bedienung ist relativ einfach. Das Prinzip ist wie folgt (der Sekundärantikörper ist mit HRP markiert): Das Reaktionssubstrat ist Peroxid + Luminol. Wenn es auf HRP trifft, strahlt es Licht aus, das den Film freilegen und die Bänder auswaschen kann. Messen Sie die Proteinkomponenten, die von spezifischen, durch Elektrophorese getrennten Zielgenen exprimiert werden. Diese Technik wird auch häufig verwendet, um den Proteinspiegel zu bestimmen.

3. Probenvorbereitung

1. Extraktion des Gesamtproteins aus einschichtigen adhärenten Zellen:

2. Extraktion des Gesamtproteins aus Geweben:

3. Extraktion des Gesamtproteins aus medikamentenbehandelten anhaftenden Zellen.

Western Blotting, eine Methode zur Identifizierung von Krankheiten, die durch falsch exprimierte Gene verursacht werden. Dieser Vorteil, das die Krankheit verursachende Antigen schnell finden und den spezifischen Antikörper (ein Protein) anfärben zu können, wird häufig bei der Erforschung genetischer Krankheiten, genetischer Probleme und der Krankheitserkennung genutzt. Basierend auf seiner Herstellung werden auch neue Nachweistechnologien entwickelt, wie beispielsweise die Southern-Blot-Hybridisierungsmethode.